實驗室不銹鋼發酵罐作為微生物培養、代謝產物合成及生物反應研究的核心設備，憑借耐腐蝕、易清潔、控溫精準的優勢，廣泛應用于微生物學、生物工程、食品科學等領域。其操作規范性直接決定發酵體系的穩定性與實驗重復性，而滅菌流程則是規避雜菌污染、保障實驗成功的關鍵前提。本文將詳細梳理實驗室不銹鋼發酵罐的標準操作流程與核心滅菌方法，為實驗人員提供可落地的實操指南。
 

　　一、實驗室不銹鋼發酵罐操作流程
 

　　實驗室不銹鋼發酵罐的操作需遵循“準備-調試-發酵-收尾”的閉環邏輯，核心是精準控制溫度、pH、溶氧、攪拌等關鍵參數，滿足微生物生長及代謝需求。
 

　　(一)操作前準備：筑牢實驗基礎
 

　　設備檢查：逐一核查發酵罐核心組件狀態——罐體及密封件無破損、滲漏；攪拌槳轉動靈活無卡頓；溫度傳感器、pH電極、溶氧電極等探頭清潔無劃痕；進氣管、補料管、排氣管等管路通暢無堵塞；安全閥、壓力表等安全部件在校驗有效期內。同時檢查配套設備(如空壓機、冷水機、蠕動泵、滅菌鍋)是否正常運行。
 

　　物料準備：根據發酵配方精準配制培養基，確保各組分(碳源、氮源、無機鹽、微量元素等)稱量準確并充分溶解，避免結塊。對易氧化或熱敏性組分，需單獨配制并采用無菌過濾(0.22μm濾膜)方式后續補加。準備好菌種懸浮液，確保菌種活性達標且濃度符合接種要求。
 

　　管路連接與密封：按發酵流程連接各管路——進氣管連接無菌空氣系統，排氣管接入冷凝裝置及尾氣處理系統，補料管連接無菌補料瓶，取樣管配備無菌采樣閥。連接后旋緊各接口螺母，確保密封嚴密(可通過后續壓力測試驗證)，避免發酵過程中漏氣或雜菌侵入。
 

　　(二)設備調試：精準設定參數
 

　　空載調試：接通發酵罐總電源，啟動控制系統，依次測試攪拌系統(調整轉速至50-100rpm，觀察攪拌槳運行平穩性)、溫度控制系統(設定37℃，檢查加熱或制冷模塊是否正常啟停)、pH控制系統(用標準緩沖液校準pH電極，確保讀數誤差≤±0.05)、溶氧控制系統(校準溶氧電極，通入空氣后觀察讀數變化是否靈敏)。
 

　　培養基裝填與參數預設：將配制好的培養基通過無菌漏斗注入發酵罐內，裝填量控制在罐體有效容積的50%-70%(避免發酵過程中泡沫溢出或溶氧不足)。關閉投料口后，在控制系統中預設核心參數——溫度(如細菌37℃、真菌28℃)、攪拌轉速(根據菌種需求設定50-300rpm)、通氣量(通常為0.5-2vvm，即每體積培養基每小時通入0.5-2體積無菌空氣)、pH值(如細菌7.0-7.2、酵母4.5-5.5)及補料策略(補料時間、補料速率)。
 

　　(三)發酵運行：動態監控與調控
 

　　接種操作：采用無菌操作技術進行接種——對接種口進行酒精擦拭消毒，開啟接種口后迅速將菌種懸浮液注入罐內，注入后立即旋緊接種口螺母。接種過程需快速且規范，避免空氣暴露時間過長引入雜菌。
 

　　參數監控與調整：發酵初期每1小時記錄一次溫度、pH、溶氧、攪拌轉速等參數，穩定后可延長至2-4小時記錄一次。根據參數變化動態調控：溫度偏離設定值時，通過加熱或制冷模塊調整；pH下降時補加無菌氨水或NaOH溶液，pH上升時補加無菌鹽酸或有機酸；溶氧過低時，可提高攪拌轉速、增大通氣量或通入純氧；出現大量泡沫時，手動加入無菌消泡劑或啟動自動消泡系統。
 

　　取樣與檢測：按實驗需求定時取樣，取樣前對取樣閥進行酒精消毒并放掉少量發酵液沖洗管路，再收集樣品。樣品需及時檢測菌體濃度(如OD600測定)、代謝產物含量(如高效液相色譜分析)、培養基殘留組分等，為發酵進程判斷及參數調整提供依據。
 

　　(四)發酵收尾：規范停機與清理
 

　　停機操作：當發酵達到預設終點(如菌體濃度峰值、代謝產物最大產量)，先關閉加熱/制冷模塊、攪拌系統及通氣系統，再切斷總電源。緩慢打開排氣閥卸壓，待罐內壓力降至常壓后，打開出料口收集發酵液。
 

　　初步清理：及時倒空罐內殘留發酵液，用自來水沖洗罐體內部、攪拌槳及探頭表面，去除明顯的菌體附著和培養基殘留。對管路系統，可通過通入高壓自來水沖洗，確保無殘留積液。
 

　　二、實驗室不銹鋼發酵罐滅菌流程
 

　　雜菌污染是發酵實驗失敗的主要原因之一，實驗室不銹鋼發酵罐的滅菌需遵循“全面覆蓋、徹底殺滅”原則，核心針對罐體、培養基、管路及附件進行滅菌，常用方法為濕熱滅菌(高壓蒸汽滅菌)，特殊場景可配合干熱滅菌或化學滅菌。
 

　　(一)滅菌前準備：排查與預處理
 

　　設備與管路檢查：確認發酵罐密封件(如硅膠密封圈)無老化，管路接口無松動；檢查滅菌鍋水位是否達標，安全閥、排氣閥功能正常。對不耐高溫的組件(如部分pH電極、溶氧電極)，需提前拆除并更換為滅菌專用堵頭或采用單獨無菌處理。
 

　　罐體與管路預處理：用去離子水沖洗罐體及管路，去除殘留的洗滌劑或雜質。將培養基注入罐內后，開啟攪拌槳攪拌5-10分鐘，確保培養基均勻分布，避免局部結塊影響滅菌效果。
 

　　(二)核心滅菌方法：濕熱滅菌操作(常用)
 

　　濕熱滅菌利用高壓蒸汽的高溫(121℃)和高濕度殺滅微生物及芽孢，適用于罐體、培養基、管路等耐高溫組件，具體流程如下：
 

　　密封與進氣：關閉發酵罐所有開口(投料口、取樣口、出料口)，旋緊各接口螺母，確保罐體密封。將發酵罐的排氣管、進氣管與滅菌鍋或專用滅菌蒸汽發生器連接，開啟進氣閥，緩慢通入蒸汽，排除罐內及管路中的冷空氣(冷空氣殘留會導致局部溫度不足，滅菌不徹底)。
 

　　升壓與保溫：待排氣管連續排出均勻蒸汽(無冷空氣夾雜)后，關閉排氣閥，開始升壓。當罐內壓力升至0.1MPa(表壓)時，溫度達到121℃，維持該壓力和溫度30-60分鐘(根據培養基成分調整：含淀粉、蛋白質等難滅菌組分時延長至60分鐘，普通培養基30分鐘即可)。滅菌過程中密切監控壓力和溫度，若壓力下降需及時補通蒸汽。
 

　　降壓與冷卻：滅菌結束后，先緩慢打開排氣閥卸壓，待壓力降至0.02MPa時，打開冷卻系統(如冷水機)對罐體進行降溫。當罐內溫度降至40-50℃(避免溫度過高接種導致菌種失活，過低導致培養基凝固)、壓力降至常壓后，關閉冷卻系統，準備接種。
 

　　(三)輔助滅菌方式：適配特殊場景
 

　　干熱滅菌：針對無法采用濕熱滅菌的組件(如金屬取樣勺、無菌操作臺內的附件)，放入干熱滅菌箱中，在160-180℃下滅菌2-3小時，滅菌后自然冷卻至室溫備用。
 

　　化學滅菌：對不耐高溫的管路或表面(如部分塑料管路、傳感器探頭)，用75%酒精擦拭消毒或浸泡30分鐘，再用無菌生理鹽水沖洗去除殘留酒精，避免化學試劑對菌種產生抑制。
 

　　無菌空氣系統滅菌：發酵過程中通入的空氣需無菌，可通過高溫滅菌(將空氣加熱至121℃維持30分鐘)或濾芯過濾(采用0.22μm無菌濾芯)方式處理，確保通入罐內的空氣無雜菌。
 

　　(四)滅菌后驗證與維護
 

　　滅菌效果驗證：可采用“空白培養法”驗證——滅菌后不接種，將發酵罐置于發酵設定溫度下培養24-48小時，若培養基無渾濁、無菌體生長，說明滅菌合格；也可采用生物指示劑(如嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢)，滅菌后培養指示劑，若指示劑不變色則滅菌合格。
 

　　組件復位與保存：滅菌合格后，將提前拆除的探頭(如pH、溶氧電極)用無菌生理鹽水沖洗后安裝復位，確保接口密封。未立即使用的發酵罐，需保持罐體干燥，可通入無菌空氣吹干內部，關閉所有開口后備用。
 

　　三、操作與滅菌關鍵注意事項
 

　　安全優先：滅菌過程中嚴禁擅自打開罐體或滅菌鍋，卸壓時需緩慢操作，避免壓力驟降導致培養基暴沸；操作攪拌系統時，禁止將手或工具伸入罐內，防止機械損傷。
 

　　無菌操作貫穿全程：接種、取樣、補料等環節需在無菌操作臺內進行，操作人員需規范穿戴無菌服、手套、口罩，避免人為引入雜菌。
 

　　設備定期維護：每月檢查發酵罐密封件老化情況，及時更換；每3-6個月校準溫度傳感器、pH電極、溶氧電極及壓力表，確保參數檢測精準；滅菌后及時清理罐體，避免培養基殘留腐蝕不銹鋼內壁。
 

　　參數記錄完整：詳細記錄操作過程中的溫度、pH、溶氧、攪拌轉速等參數，以及滅菌的壓力、溫度、保溫時間等信息，為實驗重復和問題排查提供依據。
 

　　綜上，實驗室不銹鋼發酵罐的操作與滅菌流程需遵循“精準控制、無菌保障”的核心原則。規范的操作流程能確保發酵參數穩定，提升實驗重復性；嚴格的滅菌流程能從源頭規避雜菌污染，保障實驗成功。通過熟練掌握上述流程及注意事項，可充分發揮發酵罐的實驗價值，為微生物研究及生物工程實驗提供可靠支撐。